澳门葡京网站:莽草酸抑制BLM解旋酶活性及肝癌细胞的研究

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 [摘要] 目的 研究莽草酸( shikimic acid)对BLM 解旋酶的生物学特性的影响及对肝癌细胞的抑制作用。方法 2012年11月—2013年7月应用荧光偏振技术研究莽草酸对 BLM 解旋酶的 DNA 结合活性,CCK-8检测莽草酸对肝癌细胞增殖的抑制作用。 结果 培养24 h,A100(100 μmol/L)、A50(50 μmol/L)、A25 (25 μmol/L)三组与不加药对照组相比,抑制率分别为25.73%、21.31%、18.25%,对肝癌细胞HepG2增殖具有抑制作用(P<0.05)。结论 ①莽草酸不能结合BLM 解旋酶,不能抑制其与 DNA 的结合,不能抑制BLM 解旋酶的生物学活性。②莽草酸对HpG2细胞的生长有一定的抑制作用,HpG2细胞的生长抑制作用随药物作用时间的延长有减弱的表现。③莽草酸抑制肿瘤细胞生长的作用机制不是其通过对BLM解旋酶DNA结合活性的抑制来实现的。
  [关键词] 莽草酸; BLM 解旋酶; DNA 结合活性; HpG2; CCK-8
  [中图分类号] R5 [文献标识码] A [文章编号] 1674-0742(2016)06(a)-0009-03
  [Abstract] Objective To study the effects of shikimic acid on biological properties of BLM helicase and inhibitory effect on hepatoma cells. Methods From November 2012—July 2013,effects of shikimic acid on DNA-binding activity were detected by fluorescence polarization; Effects of shikimic acid on the growth of hepatoma cells were detected by CCK-8. Results Culture for 24 h, compared with the control group, the inhibition rate of A100 (100 μmol/L) ,A50 (50 μmol/L) and A25 (25 μmol/L) group were 25.73%, 21.31% and 18.25% respectively(P<0.05). Conclusion 1.Shikimic acid can not bound to BLM helicase ,inhibit its binding to DNA and inhibit the biological activities of the helicase .2. Shikimic acid have a mild inhibitory effect on the growth of hepatoma cancer cell line HepG2,but its inhibitory effect decreased with the drug action time prolonged.3.the mechanism of shikimic acid to inhibit the growth of HepG2 cells is not the activity suppression on the DNA binding activity of the BLM helicase.
  [Key words] Shikimic acid; BLM helicase; DNA binding activity; HpG2; CCK-8
  解旋酶第二大超家族中的RecQ解旋酶家族是其中最保守的一个家族,RecQ解旋酶家族在各种生物体的遗传稳定性的维持中发挥着非常重要的作用[1]。目前仍未见有关人 DNA 解旋酶结构、功能受莽草酸影响的相关报道。该课题于2012年11月—2013年7月采用荧光偏振和CCK-8技术,研究了莽草酸对 BLM642-1290解旋酶的结构和功能的影响,为人类BLM 解旋酶缺陷与肿瘤、遗传性疾病、环境相关疾病关系及致病机制的研究提供理论依据。
  1 资料与方法
  1.1 BLM642~1290解旋酶的制备
  BLM642~1290重组菌pET-15b-BLM642-1290-BL21由法国巴黎第十一大学居里研究所的奚绪光主任研究员馈赠.含有 6 个组氨酸串联标签(6×His)的 BLM 重组大肠杆菌,IPTG诱导BLM解旋酶表达20 h(18℃、190 rpm),收集菌体超声破碎,经镍离子亲和层析柱分离纯化,获得可用于开展酶活性研究的重组BLM解旋酶。莽草酸购自阿拉丁(aladdin)公司。
  1.2 DNA 底物
  带有荧光标记的和不带标记的单链DNA(ssDNA)底物:委托北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司合成。序列如下:A1(45bp):5′-AATCCGTCGAGCAGAGTTAGG ttaggttaggttagtttttttttt-3’;A2(21bp):3′-FAM-TTAGGCAGCTCGTCTCAATCC-5’。(注:FAM为羧基荧光素)
  1.3 莽草酸对大肠杆菌BLM解旋酶结合活性影响的检测
  采用两种方法完成:①向测定管中加入ddH2O、15 μL 10×Buffer、3 μL DNA(双链DNA(A1A2)、单链DNA(A2)),置于荧光偏振仪中检测荧光各向异性值至稳定,加入不同终浓度的莽草酸,测定荧光各向异性值至稳定,再加入BLM解旋酶使DNA底物饱和,测定荧光各向异性值至稳定。记录荧光各向异性值的变化。②向测定管中加入ddH2O、15 μL 10× Buffer、3μL DNA(双链DNA(A1A2)、单链DNA(A2)),置于荧光偏振仪中检测荧光各向异性值至稳定,加入BLM解旋酶使DNA底物饱和,测定荧光各向异性值至稳定,加入不同终浓度的莽草酸,测定荧光各向异性值至稳定。本实验中通过调节ddH2O的体积,使反应体系总体积保持在150 μL。 1.4 莽草酸对肝癌细胞系HpG2生长抑制作用的研究
  CCK-8检测莽草酸对肝癌细胞增殖的抑制作用。
  1.4.1 实验分组 正常对照组:10%FBS的高糖DMEM。乙醇对照组:10%FBS的高糖DMEM+无水乙醇(浓度小于0.01%)。实验组10%FBS的高糖DMEM+莽草酸(0.5,2.5,5.0,10.0,25.0,50.0,100 μmol/L)
  1.4.2 CCK-8检测莽草酸对肝癌细胞增殖的抑制作用
  ①在24孔板里培养肝癌HpG2细胞,分别于一周内每天天消化细胞进行计数,得出细胞生长曲线。②取处于生长对数期的肝癌细胞,在96孔板中接种细胞悬液(8×103/孔),将96板放在培养箱中预培养(37℃,5% CO2)。③细胞贴壁后,对实验组和对照组进行饥饿培养3 h,后根据实验分组,加入莽草酸培养细胞,设无细胞组为空白对照组,每组设5个复空,分别于24,48和72 h后向每孔加入10 μL CCK溶液和90 uL的细胞培养基。④将培养板在培养箱内孵育1~4 h。⑤用酶标仪测定在450 nm处的吸光度。
  1.5 统计方法
  全部资料采用SPSS 17.0统计学软件进行分析。药物组与不加药物对照组BLM表达水平比较,采用两独立样本t检验,计数资料以%表示,采用χ2检验,以P<0.05为差异有统计学意义。
  2 结果
  2.1 莽草酸对 BLM642-1290解旋酶结合活性的影响
  莽草酸对 BLM642-1290解旋酶的结合活性无明显的影响( Fig1) 。无论以 dsDNA( Fig 1B,D) 还是 ssDNA( Fig 1A,C) 作底物时,体系的荧光各向异性值均无明显变化(P>0.05),说明莽草酸不能抑制 BLM 解旋酶的结合活性。
  图A、B.随着莽草酸浓度升高,单链DNA(A2)和双链DNA(A1A2)与莽草酸反应后荧光偏振值无明显变化,说明莽

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